阿爾茨海默病（AD）是一種常見(jiàn)的慢性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。近年來(lái)研究顯示，突觸（樹(shù)突棘）丟失是導(dǎo)致AD認(rèn)知障礙的主要原因。Cdc42是小G蛋白R(shí)ho亞家族的成員，在調(diào)節(jié)突觸可塑性中起著重要作用。Cdc42GAP是Cdc42活性的負(fù)調(diào)控因子，調(diào)控其從活性狀態(tài)轉(zhuǎn)化為非活性狀態(tài)。不過(guò)，目前很少有研究關(guān)注Cdc42在阿爾茨海默病進(jìn)展中的作用。

(相關(guān)資料圖)

近日，來(lái)自南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院的張璐和張琳教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表了題為“Cdc42GAP deficiency contributes to the Alzheimer’s disease phenotype”的文章，展示了課題組最新的研究成果。該研究旨在探索Cdc42信號(hào)通路的激活是否與阿爾茨海默病樣表型有關(guān)。

Cdc42GAP缺乏損害認(rèn)知和空間記憶

研究者收集了11個(gè)月大的野生型（WT）小鼠、GAP（Cdc42持續(xù)激活小鼠，即Cdc42GAP敲除雜合小鼠）和AD模型小鼠（APP/PS1）的海馬體和皮層組織，以檢測(cè)Cdc42信號(hào)通路。結(jié)果顯示， GAP小鼠和AD小鼠的海馬體和皮層中活化的Cdc42均顯著增加；且Cdc42信號(hào)通路下游PAK和cofilin的磷酸化水平均有所升高，表明Cdc42GAP缺陷小鼠和AD小鼠中Cdc42的信號(hào)傳導(dǎo)通路均發(fā)生活化。

此外，研究者將GAP小鼠與AD小鼠雜交，創(chuàng)建了同時(shí)具有AD小鼠表型和Cdc42GAP缺陷的GAP/AD小鼠，并使用4和11個(gè)月大的小鼠（分別代表年輕和老年階段），探討Cdc42GAP缺乏對(duì)學(xué)習(xí)及認(rèn)知功能的影響。在新物體識(shí)別測(cè)試中，4月齡GAP小鼠已經(jīng)出現(xiàn)明顯的認(rèn)知損傷，且GAP/AD小鼠認(rèn)知功能損傷進(jìn)一步加重，表現(xiàn)為與新物體互動(dòng)時(shí)間更少，互動(dòng)頻率也更低（圖1B-C）。而且，老年GAP小鼠表現(xiàn)出比年輕小鼠更嚴(yán)重的識(shí)別和記憶障礙。這些結(jié)果表明，Cdc42GAP缺乏會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，這種障礙可能會(huì)隨著年齡的增長(zhǎng)而惡化。

在避暗實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)與上述新體物識(shí)別測(cè)試類(lèi)似的結(jié)果，表明Cdc42GAP缺乏與識(shí)別和記憶功能障礙也有關(guān)系。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，GAP和GAP/AD小鼠顯示出穿越目標(biāo)象限平臺(tái)的次數(shù)減少，將目標(biāo)平臺(tái)轉(zhuǎn)換位置后，再次進(jìn)行訓(xùn)練和檢測(cè)，與上述結(jié)果相似（圖1H-I），年長(zhǎng)的GAP小鼠的表現(xiàn)比年輕GAP小鼠差，表明Cdc42GAP缺乏可能會(huì)損害空間記憶功能。

圖1 Cdc42GAP 缺乏導(dǎo)致認(rèn)知異常，隨著年齡的增長(zhǎng)，出現(xiàn)更嚴(yán)重的行為缺陷

Cdc42GAP缺乏誘導(dǎo)神經(jīng)元衰老和樹(shù)突棘丟失并伴有F-肌動(dòng)蛋白解聚

研究者以神經(jīng)元衰老標(biāo)志物SA-β-gal評(píng)估Cdc42GAP缺乏在神經(jīng)元衰老中的作用。結(jié)果顯示，年輕GAP小鼠的海馬和皮層神經(jīng)元中SA-β-gal水平顯著升高，GAP/AD小鼠衰老更顯著，而且年老GAP/AD小鼠的衰老程度明顯更嚴(yán)重，表明Cdc42GAP缺乏誘導(dǎo)并加速了神經(jīng)元衰老（圖2）。

此外，研究者探索了Cdc42GAP在視覺(jué)皮層和海馬兩個(gè)腦區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突棘可塑性中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cdc42GAP缺乏會(huì)導(dǎo)致小鼠海馬和皮層突觸可塑性的長(zhǎng)期損傷。通過(guò)檢測(cè)年老小鼠海馬和皮層中神經(jīng)元樹(shù)突棘的F-肌動(dòng)蛋白和G-肌動(dòng)蛋白，發(fā)現(xiàn)GAP和AD小鼠的海馬和皮層中F-/G-肌動(dòng)蛋白的比例顯著降低，表明Cdc42GAP缺乏誘導(dǎo)樹(shù)突棘丟失和F-肌動(dòng)蛋白解聚。

圖2 Cdc42GAP缺乏誘導(dǎo)神經(jīng)元衰老

Cdc42GAP缺乏誘導(dǎo)并加速tau磷酸化和淀粉樣蛋白β的產(chǎn)生

接下來(lái)，研究者使用年老小鼠研究Cdc42GAP缺乏在tau磷酸化和Aβ產(chǎn)生中的作用。免疫熒光分析顯示，GAP小鼠的海馬和皮層中的tau磷酸化（p-T231/AT8）水平顯著升高（圖3）。與GAP和AD小鼠相比，GAP/AD小鼠中的tau過(guò)度磷酸化進(jìn)一步增加，表明Cdc42GAP缺乏可能有助于tau磷酸化的進(jìn)展。另外，GAP/AD小鼠的Aβ1-42和Aβ1-40水平顯著升高。這些結(jié)果表明，Cdc42GAP缺乏誘導(dǎo)并加速tau磷酸化和Aβ1-40和Aβ1-42的產(chǎn)生。

圖3 Cdc42GAP缺乏在11個(gè)月大的小鼠中誘導(dǎo)阿爾茨海默病表型

Cdc42GAP缺乏可能通過(guò)激活GSK-3β誘導(dǎo)阿爾茨海默病表型

證明了LH Nts神經(jīng)元的Nts和GABA共同釋放介導(dǎo)了這種行為效應(yīng)[]。為探索Cdc42GAP缺陷小鼠阿爾茨海默病表型的潛在機(jī)制，研究者對(duì)年老WT和GAP小鼠的海馬進(jìn)行了定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GAP小鼠微管相關(guān)蛋白tau（MAPT）許多位點(diǎn)發(fā)生磷酸化；同時(shí)，GSK-3βSer-389位點(diǎn)磷酸化水平顯著下降。

接下來(lái)，研究者通過(guò)蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)GAP、AD和GAP/AD小鼠的海馬和皮層中GSK-3βSer-9位點(diǎn)和Ser389位點(diǎn)磷酸化水平顯著降低，而且GAP/AD小鼠GSK-3βSer-9和Ser389的磷酸化水平低于AD小鼠。此外，GAP、AD和GAP/AD小鼠的海馬和皮層中磷酸化GSK-3βTyr-216的水平增加，其中GAP/AD鼠皮層中的Tyr-216水平高于GAP和AD鼠。

這些結(jié)果表明Cdc42GAP缺乏通過(guò)Ser-9、Ser-389處去磷酸化和/或在Tyr-216處磷酸化來(lái)激活GSK-3β，從而誘導(dǎo)并加速海馬和皮層中的阿爾茨海默病樣表型。

Cdc42持續(xù)激活誘導(dǎo)tau過(guò)度磷酸化和突觸丟失

為驗(yàn)證Cdc42GAP缺乏在tau過(guò)度磷酸化和樹(shù)突棘丟失中的機(jī)制，研究者制備了Cdc42組成型激活和顯性負(fù)效突變慢病毒，轉(zhuǎn)染進(jìn)各組小鼠海馬和皮質(zhì)原代神經(jīng)元，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，Cdc42持續(xù)激活誘導(dǎo)海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元tau磷酸化水平增加，而降低Cdc42活性誘導(dǎo)其tau磷酸化水平顯著降低，表明Cdc42 GTP酶活性升高可能是阿爾茨海默病tau過(guò)度磷酸化的原因。

接下來(lái)，研究者通過(guò)分析小鼠海馬和皮層原代神經(jīng)元突觸可塑性發(fā)現(xiàn)，Cdc42持續(xù)激活誘導(dǎo)海馬和皮層神經(jīng)元樹(shù)突棘丟失和衰老水平升高，表明Cdc42 GTPase活性升高與阿爾茨海默病樣樹(shù)突棘丟失有關(guān)。

阿爾茨海默病患者大腦皮質(zhì)切片中Cdc42信號(hào)通路和GSK-3β被激活

此外，研究者收集了AD患者和健康對(duì)照（HC）大腦的皮質(zhì)石蠟切片標(biāo)本，并通過(guò)免疫化學(xué)染色評(píng)估Cdc42信號(hào)通路和GSK-3β活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AD患者皮層中的Cdc42-GTPase與HC相比顯著增加，磷酸化-cofilin（p-cofilin（Ser-3））和磷酸化-PAK1（p-PAK1（Ser-199））水平也有所增加，表明激活的Cdc42信號(hào)通路可能導(dǎo)致人類(lèi)阿爾茨海默病相關(guān)神經(jīng)元退行性改變（圖4）。

此外，Aβ1-40、Aβ1-42和APP代謝產(chǎn)物CTFs在AD患者中顯著升高，表明Cdc42GAP缺乏活化了Cdc42信號(hào)通路，激活的GSK-3β在阿爾茨海默病患者中起著至關(guān)重要的作用。

圖4 阿爾茨海默病患者的皮層中Cdc42通路和GSK-3β活性被激活

結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)Cdc42GAP缺乏在4月齡和11月齡的小鼠中誘導(dǎo)了認(rèn)知功能障礙和突觸（樹(shù)突棘）丟失，并隨著年齡的增長(zhǎng)有所惡化；11月齡的小鼠中tau磷酸化和Aβ的產(chǎn)生也有所增加，這與AD小鼠的表型一致。另外，研究者發(fā)現(xiàn)在AD小鼠中Cdc42-GTPase活性升高，同時(shí)伴有Cdc42-PAK1-cofilin信號(hào)通路激活。通過(guò)對(duì)11月齡GAP小鼠海馬的定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果表明GSK-3β活性的升高可能與tau異常磷酸化和Aβ增加這些病理?yè)p傷有關(guān)。

更重要的是，Cdc42-GTPase通路和GSK-3β活性在AD患者中也被激活。這些結(jié)果表明，Cdc42GAP缺乏引起的Cdc42活性增加可能通過(guò)激活GSK-3β誘導(dǎo)阿爾茨海默病樣表型，導(dǎo)致阿爾茨海默病的認(rèn)知功能缺陷。因此，Cdc42可能是改善阿爾茨海默病認(rèn)知功能障礙的治療靶點(diǎn)。

原文鏈接：

/brain/awad184

參考文獻(xiàn)

Zhu M, Xiao B, Xue T, et al. Cdc42GAP deficiency contributes to the Alzheimer's disease phenotype [published online ahead of print, 2023 May 31]. Brain. 2023;awad184. doi:/brain/awad184

編譯作者：Charlie Brown (brainnews創(chuàng)作團(tuán)隊(duì))

校審：神經(jīng)小子 (brainnews編輯部)

本通訊稿經(jīng)張璐和張琳?qǐng)F(tuán)隊(duì)校對(duì)，特此感謝！